產(chǎn)品內(nèi)容

產(chǎn)品簡介

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8），是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測的試劑盒。

CCK-8試劑中含有WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）是一種類似于MTT的化合物，它在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸-二甲酯（1-Methoxy PMS）存在條件下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物Formazan （參考圖1），生成的Formazan數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析，細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。

操作步驟

• 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)）

1. 制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2. 接種到 96 孔板中：按比例（例如：1/2 比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做 3-5 個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組 3-6 個(gè)重復(fù)孔。每孔約 100μl 細(xì)胞懸液。

3. 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng) 2-4 小時(shí)，如果不需要貼壁，這

   ^{步可以省去。}

1. 每孔加入 10μl CCK-8 增強(qiáng)型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比較少，有可能因試劑沾在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含 10% CCK-8 的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。

2. 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時(shí)間后測定 450nm 吸光度，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X

   軸)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y 軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時(shí)間。）

• 細(xì)胞活性檢測

1. 制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2. 接種到 96 孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約 100μl 細(xì)胞懸液，可設(shè)置 3 個(gè)

   重復(fù)孔。

3. 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng) 2-4 小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4. 每孔加入 10μl CCK-8 增強(qiáng)型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比較少，有可能因試劑沾在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含 10% CCK-8 的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。注意不要在孔中生成氣泡，以免影響吸光度的檢測。

5. 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 0.5-4 小時(shí)：細(xì)胞種類不同，形成的 Formazan 的量也不一樣，對于大多數(shù)情況孵育 1 小時(shí)即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的 Formazan 很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6 小時(shí)）。

6. 測定 450nm 吸光度：如果暫時(shí)不測定吸光度，可以向每孔中加入 10μl CCK-8 反應(yīng)終止液，遮蓋培養(yǎng)板避光保存在 2-8℃，在 7 天內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化；或者可以向每孔中加入 10μl 自己配制的 0.1M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條

   件下，在 24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。